Caracterización de la microbiota NSLAB

Los principales grupos de bacterias que caracterizan a las NSLAB son Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Enterococcus. Esta microbiota es esencialmente descontrolada, y puede desarrollarse en amplios rangos de pH y temperatura, y el predominio de algunas especies en detrimento de otras está determinado por la capacidad de utilizar los sustratos disponibles, a saber: metabolización de la lactosa y/o del citrato de calcio; además de la racemización de la molécula de lactato.

Las actividades proteolíticas del grupo de Lactobacillus pueden contribuir a la acumulación de péptidos amargos que dan lugar a sabores extraños y a defectos de textura como la formación de gases. Estas bacterias también son capaces de formar biofilms en los equipos, sobreviviendo a los efectos de los desinfectantes y los sistemas de limpieza in situ (CIP por sus siglas en inglés). Algunas cepas pueden impactar en la decoloración del producto en condiciones anaeróbicas convencionales, anaeróbicas facultativas y aeróbicas; sin embargo, el grado de decoloración depende de varios factores, como la naturaleza del colorante y la estabilidad en relación con las variaciones de temperatura y las concentraciones de oxígeno.

Del grupo de las NSLAB, Leuconostoc es una de las más importantes bacterias productoras de gas. Algunas cepas de Leuconostoc producen gas, diacetilo, acetato y acetoína a través de la metabolización del citrato. Sin embargo, los Pediococcus también son capaces de producir acetato y CO₂ a partir del lactato en presencia de O₂ y también pueden impactar en la alteración del sabor de los yogures.

Los Enterococcus, por otro lado, se encuentran ampliamente en los ambientes, pero se asocian principalmente con el tracto intestinal y su presencia en la leche hervida a menudo se asocia con una mala higiene. Estas cepas tienen una alta probabilidad de sobrevivir al proceso de pasteurización y pueden metabolizar el citrato para formar acetaldehído, acetoína, diacetilo y CO₂. Pueden presentar actividades lipolíticas y proteolíticas que van a impactar en la estructura de la cuajada formada durante la fermentación, provocando desestabilización de la base láctea, pérdida de textura y aumento de la sinéresis.

La importancia de la higienización del proceso de producción

Además de la leche y otras materias primas, el mantenimiento de la calidad del yogur se rige por una multiplicidad de factores interrelacionados, como la limpieza de las superficies que entran en contacto con el producto, los equipos del proceso, las máquinas de envasado y los materiales de empaque.

Después de procesar la leche y derivados, los equipos comienzan a presentar residuos de alto valor nutritivo, como carbohidratos, grasas, proteínas y minerales. Este aumento de la carga de materia orgánica durante el ciclo de procesamiento es susceptible a la multiplicación microbiana, dado que proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos que permanecen en los equipos.

Cuanto más largo sea el ciclo de producción, mayor será la carga de residuos, lo que puede dar lugar a la formación de biofilms que dificultan la limpieza debido a la adherencia de los constituyentes de la leche. El biolfilm tiene el potencial de actuar como fuente de contaminación microbiana crónica, lo que puede comprometer la calidad de los productos. Están representados por poblaciones de bacterias que se adhieren entre sí y/o a las superficies y son capaces de formar micro o macro colonias en los equipos. Por tanto, es importante que el CIP se lleve a cabo con eficacia, garantizando la eliminación de la suciedad para controlar mejor la proliferación de contaminantes.

Métodos de detección

Controlar la contaminación por NSLAB es de gran importancia, dado el gran impacto que tiene en la calidad del yogur, los costos operativos de la industria, así como en la seguridad y confianza de los consumidores.

Para la detección microbiológica, se conocen las dificultades en la determinación de microcolonias y la imposibilidad de identificar cepas indígenas de NSLAB por métodos de fenotipado. Sin embargo, se puede identificar la presencia de la microbiota mediante el análisis del recuento total de NSLAB y el recuento de bacterias fermentadoras de citrato.

Para la determinación de NSLAB total se utiliza el medio de cultivo MRS y/o M17+Vancomicina, lo que da lugar al crecimiento de colonias, en su mayoría compuestas por una gran variedad de bacterias del grupo bacilos, en las que no es posible distinguirlas e identificarlas debido a la gran diversidad de cepas. Para los productos que utilizan cultivos mesófilos en su composición no se indica la aplicación de esta metodología, ya que el resultado encontrado puede ser un falso positivo.

El método de recuento total se basa en la premisa de que el yogur está compuesto, necesariamente, por las bacterias termófilas S. thermophilus y L. bulgaricus, que no se multiplican a 22 °C. Por lo tanto, si el producto no presenta en su composición la adición de bacterias mesófilas adjuntas, el crecimiento resultante puede ser relacionado con el crecimiento de la microbiota contaminante NSLAB.

Para la determinación de bacterias fermentadoras de citrato, debe considerarse el uso de un medio de cultivo de agar Leesment, enriquecido con componentes como el citrato de calcio y la carboximetilcelulosa utilizados como sustratos, favoreciendo así el crecimiento de este grupo de bacterias. En la lectura de este análisis se pueden encontrar bacterias de la familia de las enterobacterias, Pediococcus, Leuconostoc, y también bacterias del grupo de los bacilos productores de gases, como Lactobacillus plantarum.

Otra forma de detectar la contaminación por NSLAB en el proceso productivo de yogur es mediante la evaluación de la eficiencia de la limpieza CIP en las etapas del proceso que incluyen la pasteurización, las líneas de transferencia y los tanques de fermentación. Este método identifica puntos críticos de contaminación donde se produce un aumento en la carga celular contaminante, lo que favorece la recontaminación de la leche.

Considerando que todas las bacterias pertenecientes a la microbiota NSLAB son bacterias ácido lácticas, es decir, productoras de ácido láctico, el método se basa en la lectura comparativa del desplazamiento de pH de las muestras recogidas durante el proceso e incubadas a la temperatura de fermentación. Fijando el mismo delta de desplazamiento de pH, se puede concluir que cuanto mayor sea la carga de células contaminantes, menor será el tiempo de acidificación y, en consecuencia, menor deberá ser el intervalo entre cada CIP.

Ambas vías analíticas son eficientes y complementarias para la detección y control de la microbiota NSLAB, y se puede correlacionar el nivel de contaminación con las desviaciones de calidad en los yogures mencionados inicialmente.

Para la detección de biofilms, el análisis de superficie (SWAB) tras la higienización de las líneas en diferentes puntos de recolección, especialmente en lugares de difícil acceso, es también una forma eficaz de identificar los puntos críticos de contaminación.

Control de la NSLAB

Asociadas con el control de calidad de la leche y la eficiencia de la limpieza en las líneas de procesamiento de yogur, algunas prácticas adoptadas en el proceso pueden contribuir a mantener bajos los niveles de contaminación por NSLAB.

Largos intervalos de almacenamiento de la base láctea en el tanque de mezcla pueden impactar en la proliferación bacteriana, considerando que la pasteurización de la leche cruda en la recepción no es eficiente para eliminar gran parte de las bacterias que componen este grupo. Sabemos que la pasteurización reduce de forma logarítmica la carga bacteriana contenida en la leche. De este modo, cuanto mayor sea la carga contaminante de la mezcla a procesar, más probable es que el producto contenga altos niveles de contaminación.

La concentración de inóculo de cultivo añadido contribuye significativamente a proteger el producto contra la proliferación de microorganismos no deseados, ya que cuando se utiliza la dosis nominal (indicada) del cultivo, mayor será la carga celular de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y, con ello, menor será la fase LAG, evitando el crecimiento de contaminantes. En la cinética de acidificación, la fase LAG representa la fase de latencia del cultivo, es decir, el cultivo aún no comenzó su proceso de multiplicación. En este intervalo, las condiciones son ideales para la proliferación de contaminantes, ya que además de no existir competencia por la fase de adaptación del cultivo, ofrece condiciones óptimas tanto en relación con la temperatura como la oferta de sustratos. En otras palabras, cuando “estiramos” la dosis del cultivo añadido para la fermentación, menor será la carga celular, mayor será el intervalo de la fase LAG y mayor será la probabilidad de desarrollo de contaminantes.

Otra práctica que se puede adoptar es enfriar el producto justo después de que alcance el pH de corte en la etapa de fermentación, ya que el enfriamiento rápido contribuye a frenar el crecimiento de las bacterias contenedoras. Además, de forma alternativa, pero con un mayor impacto en la inversión, tecnologías de microfiltración y bactofugación se pueden emplear en el proceso para eliminar los microorganismos no deseados.

El control de la microbiota contaminante NSLAB en yogures contribuye a la reducción del desperdicio de alimentos y de generación de residuos derivados del descarte de productos, además de reducir los impactos financieros generados por problemas de desvíos de calidad y, en consecuencia, generar una mayor satisfacción y fidelización de los consumidores.

¿Cómo la grasa está presente en la leche?

La leche bovina contiene entre un 3 y un 5 % de grasa en forma de emulsión, formada por pequeños glóbulos de tamaño medio de 3 a 4 μm, estabilizados por una membrana muy fina. Hay alrededor de 15000 millones de glóbulos de grasa por mililitro de leche, que pueden variar según la raza, la etapa de lactancia y la dieta del animal. La grasa de la leche está compuesta predominantemente por triglicéridos, que representan, aproximadamente, el 98 % de la fracción lipídica total y el 2 % restante se compone de monoglicéridos y diglicéridos, ácidos grasos, fosfolípidos, esteroles y vitaminas liposolubles (A, D, E y K). El triglicérido es la combinación de una molécula de glicerol más 3 de ácidos grasos, es decir, cada glicerol se une a tres moléculas de ácidos grasos; sin embargo, hay diferentes combinaciones de ácidos grasos en un solo triglicérido debido a la gran variedad de este componente en la leche (ver gráfico anterior).

Composición de la membrana del glóbulo de grasa

La membrana que envuelve el glóbulo de grasa está compuesta principalmente de fosfolípidos y proteínas (ver figura en la página 3). Presenta funciones importantes y actúa como una barrera entre la fase acuosa de la leche y los triglicéridos, que son hidrófobos y no tienen afinidad con el agua, además de aislar y proteger los glóbulos frente a la acción de enzimas (Lipasas).

La estabilidad de la membrana del glóbulo de grasa se ve directamente afectada por el pH de la leche. A medida que el pH de la leche baja, aumenta la sensibilidad a la ruptura de esta capa protectora. Si la membrana se daña físicamente por un alto cizallamiento, se liberará la grasa presente dentro del glóbulo, conocida como grasa libre. Durante la fabricación de quesos, la grasa libre no se incorporará a la cuajada; de esta forma, aproximadamente el 10 % de esta grasa se perderá en el suero, repercutiendo en la tasa de recuperación y en el rendimiento.

Pérdidas de grasa en la fabricación de quesos

Medir el porcentaje de recuperación de grasa en la fabricación ayuda a comprender la eficiencia del proceso. La grasa tiene un gran impacto en las propiedades reológicas y sensoriales, incluso sin ejercer ningún papel activo en la etapa de coagulación. Es decir, la mejora de la tasa de recuperación está directamente relacionada con la integridad y el tamaño de los glóbulos de grasa, las características físicas de la red proteica, la eficiencia en el momento del corte y la acción termomecánica aplicada durante el proceso (ver gráfico al lado). Debido a la alta valoración de la materia grasa, optimizar la recuperación de grasa en el queso se convierte en una gran oportunidad en la búsqueda de una mayor eficiencia productiva y un aumento de la rentabilidad. Dependiendo de la composición de la leche y de la tecnología utilizada, del 85 al 95 % de la grasa quedará retenida en la cuajada y el resto se perderá en el suero. En la producción de queso mozzarella, por ejemplo, la tasa de recuperación de grasa rara vez supera el 90 % debido a las pérdidas adicionales encontradas en el proceso del hilado. Utilizando fórmulas específicas es posible medir la tasa de recuperación de grasa, identificando el porcentaje que se transfirió de la leche al queso, así como la cantidad en gramos de grasa que se necesitaron para producir 1 kg de queso. Con el objeto de medir e interpretar los datos obtenidos en el proceso, podemos correlacionar los cálculos para identificar cómo aumentar la eficiencia productiva, ya que cuanto mejor sea la tasa de recuperación, menos grasa se perderá en el suero y menor será la cantidad necesaria para fabricar 1 kg de queso (ver fórmulas a continuación).

Recuperación de grasa

Se desarrollaron varias técnicas para aumentar la recuperación de sólidos y el rendimiento en quesos, desde la optimización de los equipos utilizados en el proceso hasta tecnologías que involucran la concentración de la leche a través de micro o ultrafiltración. Generalmente, son tecnologías que implican mayores costos de inversión, un factor de complicación para la mayoría de los fabricantes. La homogeneización es un método muy utilizado en los procesos productivos de diversos productos lácteos con el fin de estabilizar la emulsión, lo que provoca una reducción del tamaño y la ruptura de los glóbulos de grasa. Los nuevos glóbulos formados son envueltos en parte por una mezcla de proteínas, siendo la caseína la principal fracción. La nueva conformación de la membrana facilita la interacción entre la grasa y la red proteica formada durante la coagulación, reteniendo más grasa en la cuajada (ver gráfico al lado). En la fabricación, excepto para grupos específicos, la práctica de la homogeneización no es común porque, además de la necesidad de inversión, la leche homogeneizada forma un coágulo con menor tendencia a la sinéresis, impactando en el aumento del contenido de humedad que genera una alta actividad acuosa y acelera las reacciones bioquímicas que provocarán el ablandamiento y las alteraciones sensoriales del queso. La ruptura de la membrana del glóbulo de grasa favorece la acción de lipasas y la lipólisis, lo que no es deseable para la mayoría de los tipos de quesos.

YieldMAX®

YieldMAX® es una fosfolipasa A1, obtenida a partir de cepas de Aspergillus oryzae capaces de hidrolizar el enlace éster Sn-1 del fosfolípido presente en la membrana del glóbulo de grasa, generando un compuesto llamado lisofosfolípido. Este compuesto emulsiona el agua y la grasa durante el procesamiento, y también interactúa con las proteínas, que forman complejos lipoproteicos (ver figura en la página 5). El uso de YieldMAX® no requiere grandes inversiones y favorece una mayor retención de grasa en la cuajada, especialmente en quesos de pasta hilada y quesos frescos, sin interferir con las propiedades de coagulación; es decir, actúa sobre el aumento del rendimiento de estos quesos. Presenta una actividad estable en amplios rangos de pH y temperatura, con dosis que varían entre 2 y 5 LEU/g de grasa en la leche. Uno de los posibles efectos derivados de la aplicación de fosfolipasa es la formación de espuma, relacionada con una característica inherente al proceso emulsionante, ya que la propiedad tensioactiva de la enzima reduce la tensión superficial, lo que resulta en la incorporación de aire. Es posible minimizar el impacto de la generación de espuma a través de adaptaciones, tanto en relación con el momento de la adición de enzimas como en los ajustes en el proceso. Para algunas categorías de quesos, las lipasas se usan para realzar el aroma, modificar el sabor y acelerar la maduración. Debido a la especificidad del enlace Sn-1 del fosfolípido, YieldMAX® no promueve la lipólisis y mantiene inalterados los atributos sensoriales y funcionales, como el corte en lonchas, el derretimiento y la elasticidad del queso mozzarella. YieldMAX® no tiene ningún impacto en la calidad y el procesamiento posterior del suero.

En la fabricación de quesos de pasta hilada, la tasa de recuperación de grasa rara vez supera el 90 %, pero con el uso de YieldMAX® es posible observar un mayor efecto sobre la retención de grasa, pudiendo obtener tasas de más del 90 %, lo que permite un menor uso de grasa en la estandarización de la leche. Para lograr resultados aún más sorprendentes, la combinación de Yield-MAX® y CHY-MAX® Supreme ha alcanzado mayores beneficios de rendimiento en los quesos de pasta hilada. Aplicaciones prácticas realizadas en Brasil en queso mozzarella, debido a la mejora significativa en la tasa de recuperación de grasa, fue posible reducir la grasa de la leche en alrededor de un 10 %, generando un volumen excedente de materia grasa de aproximadamente 3 toneladas por 1 millón de litros de leche, sin cambiar el estándar de calidad y aumentando significativamente la rentabilidad del fabricante. YieldMAX® es una enzima de la cartera de NOVONESIS, ya conocida por varios fabricantes de quesos mozzarella y/o Minas Frescal. La aplicación de esta enzima, junto con el coagulante CHY-MAX® Supreme, puede conducir a obtener ganancias de rendimiento del orden del 1 al 3 %.

Los quesos blandos (soft cheeses) maduran a partir de la corteza hacia el interior, con el uso de bacterias, levaduras o mohos.

Moho blanco

El brillo y el espesor de la capa superficial del queso con moho blanco pueden ser la marca registrada para el reconocimiento y benchmarking del consumidor. La elección del moho blanco usado tendrá un papel importante en el sabor, el tiempo de lanzamiento en el mercado y la vida útil.

Penicillium candidum

Penicillium candidum (camemberti) se usa para la fabricación de quesos madurados con moho blanco, como el Camembert y el Brie.
Las cepas son de color blanco y se caracterizan por la densidad de crecimiento y la altura del micelio en la superficie del queso, propiedades proteolíticas y lipolíticas, y la resultante formación de un sabor suave a aromático.

Las diferentes cepas son capaces de liberar compuestos aromáticos específicos, como el 2-metil-1- propanol, el 3-metil-1-butanol, ácido 2-metilbutírico, metilcetonas y alcoholes secundarios. Para algunos quesos (cuajada de fermentación láctica y quesos de cabra), están disponibles cepas con micelio gris azulado (nombre comercial P. camemberti).

El equipo de los Laboratorios de Desarrollo y Aplicación de Productos está a su disposición para brindar información adicional.

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Geotrichum candidum

Los cultivos de G. candidum también se usan frecuentemente para quesos madurados con mohos. G. candidum previene el crecimiento de P. roqueforti y el crecimiento excesivo de P. camemberti en la superficie del queso, lo que da como resultado un micelio más uniforme cuando se usa para quesos mohosos. Hay disponibles cepas especiales con propiedades anti mucor o antiamargor. Las cepas de G. candidum pueden desarrollar características similares a las de la levadura o el moho y también se usan para la maduración de quesos de corteza lavada, especialmente quesos blandos. Las cepas de G. candidum se caracterizan por actividades proteinasas, aminopeptidasas y lipolíticas con capacidad para desarrollar compuestos aromáticos típicos (metilcetonas, alcoholes secundarios, sulfuro de dimetilo y feniletanol). Con este potencial metabólico variado se puede decir que el G. candidum desempeña un papel importante en la maduración de muchos quesos blandos y semiduros, lo que resulta en una contribución positiva al desarrollo del sabor y del aroma, (cuando se usa solo o en combinación con otros cultivos de mohos para la maduración).

Cultivos geotrichum

Geotrichum – principales características

De “fermentado y fino” a “blanco y intenso”

Diferencias en la morfología entre las cepas generan una variedad de apariencias en la superficie del queso.

Penicillium roqueforti

Las cepas de Penicillium roqueforti con un aspecto verde a azul verdoso son utilizadas en quesos de vetas azules como Bavaria Blue, Gorgonzola, Roquefort, Bleu d’Auvergne, Stilton, Danablu y Petit Bleu. Además de la apariencia, las cepas de P. roqueforti se eligen por su velocidad de crecimiento y por las diferencias en las actividades proteolíticas y lipolíticas. El desarrollo del aroma varía de suave a muy picante. La hidrólisis de la grasa en monoglicéridos y diglicéridos y ácidos grasos, y la posterior producción de metilcetonas a través de la oxidación de ácidos grasos, son las principales actividades bioquímicas de los hongos en el queso azul. Los ácidos butírico (C4) y caproico (C6) y la 2-heptanona son los principales compuestos responsables del sabor fuerte y picante de los quesos azules.

Las vetas de los quesos azules

Los quesos azules se caracterizan por tener “vetas” en su interior. El color y la predominancia de las vetas de un queso azul influyen en su firma, así como en la forma en que los consumidores notan su calidad.

Penicilium roqueforti de diferentes colores para tipos de quesos azules